dna提取的流程ctab

dna提取的流程ctab？如果你對這個不了解，來看看！

轉基因食品的檢測技術分享,下面一起來看看本站小編百歐博偉生物給大家精心整理的答案，希望對您有幫助

dna提取的流程ctab1

一、概述

轉基因食品又稱遺傳修飾食品（genetically modified food），簡稱GMF或GM食品。轉基因食品大體上分為如下三類。

1、轉基因植物食品

由轉基因植物如轉基因的玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、香蕉、蘋果、菠菜等生產加工而成。

2、轉基因動物食品

如轉基因的魚、雞、牛、羊等。目的主要通過導入外源基因或對自身基因加以修飾來使受體動物降低結締組織交聯度、改善肉質．或使受體生物個體肥大，或生產營養價值高的蛋、肉、乳等。

3、轉基因微生物食品

如轉基因微生物發酵而制得的葡萄酒、啤酒、醬油等，此類食品是利用轉基因微生物（如轉基因酵母和酶）的作用而生產出來的食品。后兩類轉基因食品目前在市場上還很少。

二、ELISA技術與轉基因食品檢測

1、ELISA基本原理

建立在抗體抗原免疫學反應的基礎上。

ELISA分析法必須具備待檢測的固定相抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體、酶作用的底物三種試劑，且滿足兩個前提條件：

待檢測的抗原或抗體能夠結合到不溶性載體表面并保持活性；

標記酶能與抗原或抗體結合并同樣 保持各自生物活性。

ELISA分析基本步驟如下：①將抗原（Ag）或抗體Ab結合到固相載體平板的孔里；②待測溶液的特殊抗原或抗體結合到敏化載體表面；③加入酶標抗體使之與抗原或抗體化合物相結合；④結合物通過標記酶催化底物的顏色改變而被檢測；⑤通過最后溶液的顏色深淺對待側抗原或抗體進行定量分析。

2、ELISA分析法的靈敏度

3、ELISA分析法的要點

特異性高，獲得結果快，儀器簡單，易于操作，對人員要求不高。免卻了對樣品進行核酸提取的麻煩，同時可降低檢測的成本，由于酶既有很高的催化效率，可極大的放大反應效果，從而使測定達到很高的靈敏度和穩定性。

三、PCR技術與轉基因食品的檢測

1、PCR技術對轉基因食品的定性檢測

（1）PCR基本原理 PCR技術由美國Centus公司Kary Mullis發明，20世紀90年代逐漸成熟應用。簡單地說PcR就是利用核酸DNA聚合酶、引物和4種脫氧單核苷酸在試管內完成模板DNA的快速復制．

（2）PCR技術檢測轉基因食品的技術關鍵和理論依據

（3）PCR檢測轉基因食品的基本步驟

①待檢材料DNA提?。和ǔ＠肅TAB法從食品材料中提取核酸；

②PCR反應：設計合適引物。PCR擴增待檢樣品中的靶標DNA；

③觀測PCR產物：通過凝膠電泳分析將PCR產物展現；

④確定結果：有時為了避免假阻性，還需要對PCR產物進行限制性酶切分析進行質量控制。

2、PCR技術對轉基因食品的定量檢測

目前基于GMO特異DNA片段的定性PCR篩選方法已廣泛應用于GMO食品檢測．但是隨著各國有關GMO標簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO含量的下限已有所規定。為此，研究者在定性篩選PCR方法的基礎上發展了不同的定量GMO的PCR檢測方法。目前，國外較為成熟的方法主要有半定量PCR法、定量競爭PCR(Quantitative competitive PCR)和Real—time PCR(實時定量PCR)法等三種。

（1）半定量PCR法

①樣品DNA的提取和定量。

按常規方法提取DNA后，取部分樣品DNA在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，與已知古量的Marker比較，用計算機凝腔成像分析系統處理結果，以確定所提取的DNA量。例如，一般700mg的玉米粉可提取lμg DNA。

②PCR反應。

a.樣品DNA的質量分析

b.建立內部參照反應體系

c.測定CaMV35S啟動子的定量PCR反應

（2）定量競爭PCR法 PCR反應實質是對特定模板DNA的指數擴增放大，而在相同的條件下，獲得DNA的量與最初模板DNA的濃度成正相關，競爭定量PCR就是依據這種擴增DNA與模板DNA之間的濃度相關性設計的?；驹硎窍葮嫿ê行揎椷^的內部標準DNA片段(競爭DNA)，競爭DNA由質粒組成，帶有一個改造PCR擴增子，改造部分可以是DNA插人序列、缺失序列或者點突變，競爭DNA與待測目標DNA在同一反應管中進行PCR共擴增，因競爭DNA片段和待測DNA的大小不同，經瓊脂糖凝膠可將兩者分開，通過比較兩種條帶的量可進行定量分析。

四、生物芯片與轉基因產品檢測

就目前轉基因食品檢測中常用的ELISA和PCR技術而言，最大的缺點是檢測范圍窄，效率低，無法高通量大規模地同時檢測多種樣品，尤其是對轉基因背景一無所知的情況下。對各種候選待檢基因序列或蛋白的逐一篩查幾乎是不可能的。而目前正在研究的轉基因產品所涉及的基因數量有上萬種，今后都有可能進入商品化生產，顯而易見對進出口產品的檢測，需要有更有效的、快速、特別是高通量的檢測方法，最近幾年出現的生物芯片技術能較好地解決這一問題。生物芯片根據所載探針種類分為基因芯片和蛋白質芯片兩大類：基因芯片以DNA為探針。依據核酸雜交的原理檢測樣品中的特定基因序列；蛋白質芯片以蛋白質為探針，依據抗原抗體反應的免疫學原理檢測樣品中的特定蛋白質。

北京百歐博偉生物技術有限公司擁有對菌種、細胞、培養基、配套試劑等產品需求者的極優質服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在中國微生物菌種查詢網中獲得最優質服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業有著良好、長期和穩定的合作關系！

dna提取的流程ctab2

植物新品種侵權訴訟中DNA檢測方式的運用

——江蘇徐農種業科技有限公司訴上海市

海豐農場侵害植物新品種權糾紛案

編者按：

本期“知產視野”刊登徐農公司訴海豐農場侵害植物新品種權糾紛案。該案與前期“知產視野”刊登的案例有兩個小小的聯結點：一是被控侵權品種是徐州農科所選育的三系粳稻不育系徐9201A；二是原告為徐農公司，系徐9201A的獨占實施被許可人。該案的基本案情是，被控侵權物首先由農業行政執法部門發現固定證據并作出技術鑒定。之后在侵權訴訟中，因海豐農場對行政程序作出的鑒定報告提出異議，故一審法院重新組織鑒定，并在重新鑒定查明的事實基礎上作出侵權認定，計判賠140萬元。

海豐農場不服提起上訴。二審的主要爭點在于，被控侵權物作為自然物因保管不善發生霉變后，鑒定機構采用非國家標準進行的DNA檢測方法是否妥當？檢測報告未附圖譜是否程序違法？此外，關于一審確定的140萬元賠償額是否合理，也是二審爭議的焦點之一。

該案系江蘇高院于2009年審結的二審案件，雖然是七、八年前審結的案件，但在該案審理過程中，兩審法院就如何組織植物新品種侵權訴訟的DNA鑒定，包括對鑒定比對樣品的調取、鑒定機構的選擇、鑒定標準及鑒定方法、鑒定報告是否應當附圖譜等鑒定程序問題，以及賠償額如何計算等的裁判說理，今天看來仍具有總結的價值，值得推薦。

尤其是，對于海豐農場在訴訟中反復主張涉案DNA檢測報告應當附圖譜的問題，二審判決認為：“因國家標準并沒有要求提供圖譜，這表明文字說明和測試數據已經能夠清晰地體現測試結果，并足以據此給出鑒定結論。同時，一審在委托鑒定之前，雙方當事人亦未對測試報告的格式和內容，以及是否需要附加帶型圖譜提出特別要求。因此，在鑒定程序已經結束，鑒定機構已經完成鑒定事項且正式出具鑒定報告的情況下，再要求鑒定機構出具帶型圖譜不盡合理?！钡徟袥Q就未來可以要求附圖譜作出如下指引：“為盡量減少當事人對植物DNA鑒定報告的質疑，今后法院可以考慮在審理類似案件確定委托鑒定事項時，經征求雙方當事人意見，明確向鑒定機構提出鑒定報告附加帶型圖譜的要求?！?/p>

【裁判要旨】

1.鑒定機構在采用國家標準SDS法以及CTAB法提取DNA均無法滿足實驗要求的情況下，采用試劑盒法提取被控侵權物的DNA，符合專業領域提取DNA的常規，且技術專家出庭說明上述三種方法提取DNA均不會改變DNA的結構和性質，因而最終不會影響兩份水稻樣品DNA比對結果的科學性和準確性，該鑒定意見應予采信。

2.確定植物新品種侵權賠償數額，可以采取被控侵權實際制種數量減去其現有庫存乘以每公斤種子的銷售利潤，加上權利人為制止侵權所支出的合理費用，再從中減去酌情確定的父本所起作用并產生的利潤等，以此計算權利人的損失。

【案件信息】

一審：南京中院（2007）寧民三初字第384號民事判決書；

二審：江蘇高院（2009）蘇民三終字第0137號民事判決書。

【案情摘要】

2003年9月25日，品種權人江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所（以下簡稱徐州農科所）就其培育的徐9201A品種向國家農業部申請植物新品種權保護，2007年1月1日獲得授權，品種權號為CNA20030344.9。2007年1月3日，品種權人徐州農科所將徐9201A植物新品種權以獨占方式許可徐農公司實施。

2007年5月1日，被告海豐農場從天津豐美公司購進“津1007A”和“金恢68”品種，分別為1245公斤和692.5公斤，用于生產津粳優68雜交水稻。

2007年9月22日，鹽城市農業局到被告海豐農場一大隊對名為“津1007A”品種進行抽樣，數量為3份，每份100張劍葉；對“津粳優68F1”品種進行抽樣，數量為4份，合計1公斤，樣品代表面積700畝。

2007年9月28日，鹽城市農業局將“待檢樣品葉片、徐9201A葉片”送至江蘇省優質水稻工程技術研究中心作DNA對比檢測。檢測結果為：“共有21對引物能擴增出條帶，其中13對引物在3個樣品和5個對照間有多態性，可以將2個樣品和5個對照區分開。但是所有引物在所收到的2個樣品間的擴增結果均沒有差異?！?/p>

一審庭審中，海豐農場質證認為，由鹽城市農業局組織鑒定中作為對比用的“徐9201A葉片”系由原告提供，取樣過程被告并不知曉，鑒定程序存在不合法之處，影響鑒定結論的真實性，應當重新鑒定。同時提出，對于徐9201A樣本，在國家農業部植物新品種保護辦公室下屬國家種質保藏中心有留存，可以依據相關規定由法院調取。原告認可鑒定報告中所述“徐9201A葉片”系由其提供，同意重新鑒定并預交鑒定費用。

一審法院準許進行重新鑒定。依據國家相關法律，并經由當事人協商一致，確定如下鑒定方案：一是由一審法院至國家農業部植物新品種保護辦公室下屬國家種質保藏中心調取留存的徐9201A樣本種子，與鹽城市農業局抽樣的名為“津1007A”的葉片進行對比測試。二是鑒定方法為DNA分析方法。三是由當事人協商確定鑒定機構，協商不成的，由人民法院指定的有鑒定資格的鑒定機構、鑒定人鑒定。若沒有有鑒定資格的鑒定機構、鑒定人，指定由具有相應品種檢測技術水平的專業機構、專業人員進行鑒定。四是對于需要測試的SSR標記對數，由當事人協商確定，協商不成的，由法院商鑒定機構確定。

2008年3月31日，一審法院依法通過農業部植物新品種保護辦公室從其下屬國家種質保藏中心調取20粒徐9201A種子。因雙方當事人無法協商一致，亦未提供有司法鑒定資格的鑒定機構信息，故由一審法院指定并委托農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心（合肥）進行鑒定。2008年5月22日，一審法院將上述樣本送至鑒定機構。對于需要測試的SSR標記對數，鑒定機構認為，根據國家標準GB/T20396-2006，測試24對可以達到鑒定要求，若當事人有特殊要求，可以測試48對，再多已無必要。一審法院同鑒定機構商定在鑒定中測試48對SSR標記。

2008年10月13日，農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心（合肥）出具《測試報告》。《測試報告》正頁內容為：樣品狀態描述：徐9201A未見異常、津1007A劍葉已霉變；委托測試要求：署名為津1007A和徐9201A的兩份水稻樣品在國家標準GB/T20396-2006中規定的48對SSR標記間是否存在DNA水平差異；所用主要儀器：離心機、PCR儀PAGE電泳系統；檢驗依據：GB/T20396-2006；檢驗結論：利用國家標準GB/T20396-2006中的48個水稻SSR標記，對徐9201A和津1007A進行DNA差異分析，結果顯示：在所測試的所有標記中，未發現兩樣品間存在差異。

《測試報告》附頁內容為：樣品預處理：由于署名為津1007A的劍葉采集時間過長，且保存條件不合理，葉片枯黃發霉，需要進行處理比較。采用超純水對葉片表面的霉菌污點進行沖擦洗，并進行滅菌消毒。分別用SDS法（國家標準GB/T20396-2006中附錄A方法）、CTAB法和試劑盒法提取DNA。SDS法和CTAB法提取的DNA均為棕褐色，試劑盒法提取的DNA為無色透明溶液，感觀上符合分析要求。實驗過程：把徐9201A的種子放入30℃恒溫光照培養箱中培養幼苗，一周后，按照國家標準GB/T20396-2006中的方法提取DNA; 津1007A劍葉按照樣品預處理中的試劑盒法提取DNA。擴增國家標準GB/T20396-2006中規定的48對SSR標記，電泳，分析電泳的帶型。

一審法院組織雙方當事人對《測試報告》進行質證。原告認為，從程序和實體兩個方面，《測試報告》都是符合法律規定的，應當作為定案的依據。被告海豐農場認為，首先，津1007A劍葉檢材已被污染，無法按照國家標準GB/T20396-2006中的SDS法提取DNA，鑒定機構使用其他方法提取的DNA不能作為對比樣本。鑒定機構運用試劑盒法提取DNA并作對比，得出的鑒定結論在程序和實體兩個方面不符合法律規定，不應予以采信。其次，鑒定機構沒有將帶型圖譜附在《測試報告》中，鑒定結果缺乏證據證明。

針對當事人對《測試報告》提出的問題，2008年11月14日，農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心（合肥）給一審法院回函述稱，關于附圖譜問題，《測試報告》的格式符合要求和行業習慣做法。關于試劑盒法問題，由于署名津1007A的劍葉采集時間過長，且保存條件不合理，用國家標準GB/T20396-2006中的SDS法提取DNA不能滿足測試要求。為此，采用另外兩種常用的DNA提取方法（CTAB法和試劑盒法）提取署名津1007A樣品的DNA，并對提取的DNA進行SPS基因檢測，結果只有運用試劑盒法提取的DNA能夠滿足擴增要求。國家標準GB/T20396-2006中的SDS法和測試中的試劑盒法都是以SDS作為主要成分裂解細胞，釋放出DNA。兩者主要在DNA與其他物質分離上存在差異，SDS法是通過離心沉淀的方法把DNA和其他物質分開，試劑盒法則是通過膜選擇性吸附DNA的方法把DNA與其他物質分開。對于特殊樣品，SDS法在離心過程中干擾物會和DNA一道沉淀出來，干擾后續實驗，而試劑盒法則能將干擾物和DNA分別分離出來，滿足實驗要求。試劑盒法從本質上不會改變DNA結構和性質，且本測試為定性實驗，測試的SSR標記均為水稻特異標記。因此，運用試劑盒法提取的DNA與SDS法相比不會影響實驗結果。

【法院認為】

南京中院一審認為：

一、《測試報告》可以作為認定案件事實的依據

關于鑒定機構的資質和鑒定能力，鑒定機構農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心（合肥）系經由農業部批準設立，獲得了由中國國家認證認可監督管理委員會頒發的《資質認定計量認證證書》和國家農業部頒發的《審查認可證書》。三位鑒定人具有研究員或者助理研究員職稱，且均系《測試報告》所依據的國家標準GB/T20396-2006的起草人。雖然該鑒定機構專業從事的是轉基因成分檢測，但是國家標準GB/T20396-2006中的DNA測試與之相比，技術上具有相通性，對于實驗條件的要求也基本相同。從鑒定機構具備的資質、實驗設備和鑒定人員的能力等方面看，雖然不具備司法鑒定資質認定證書，但是客觀上具備了從事本次鑒定工作的條件，也符合全國人大常委會《關于司法鑒定管理問題的規定》第5條規定的條件，主觀上具備對鑒定過程的把握和控制能力，總體上亦符合《最高人民法院關于審理侵犯植物新品種權糾紛案件具體應用法律問題的若干規定》第三條的規定。

關于鑒定方法，本鑒定采用的DNA分析方法，為國家標準GB/T20396-2006和雙方當事人所選擇和認可，有相應的國家標準作為程序操作依據，符合相關法律的規定。對于在鑒定中運用兩種不同方法分別提取兩種樣本中的DNA，首先，從本案相關樣品的存在狀態看，是有其必要性的。由于署名津1007A的劍葉采集時間過長，且保存條件不合理，用國家標準GB/T20396-2006中的SDS法提取DNA不能滿足測試要求。鑒定機構又采用CTAB法和試劑盒法提取署名津1007A樣品的DNA，結果顯示只有試劑盒法提取的DNA能夠滿足擴增要求。因此，若不使用試劑盒法，則無法實現鑒定目的。其次，從科學的角度看，試劑盒法具備相應的科學性。鑒定中使用的試劑盒法也是以SDS作為主要成分裂解細胞，釋放出DNA，并通過膜選擇性吸附DNA的方法把DNA與其他物質分開，從而獲取所需DNA。與國家標準GB/T20396-2006中的SDS法相比，兩者在裂解細胞，釋放出DNA方法上相同，在將DNA與其他物質分離的方法上有所不同。而試劑盒法中的不同分離方法所作的只是一種物理上分離，并不會改變DNA結構和性質。因此，運用試劑盒法提取DNA是有科學依據的，也是可以信賴的。又因本次鑒定為定性實驗測試，測試的SSR標記均為水稻特異標記，所以兩種方法提取的DNA可以用來比對，并據此得出鑒定結論。被告認為應當采用同一種方法提取兩種樣品DNA的意見，一審法院不予采信。

關于《測試報告》沒有附帶型圖譜問題，《測試報告》對兩個樣品在48對SSR標記下帶型是否具有一致性均逐一作了分析和判斷，格式和內容表述方式符合國家標準GB/T20396-2006的要求和相關法律的規定。

二、被告海豐農場侵犯了涉案植物新品種權，應當承擔相應的民事責任

原告徐農公司依法受讓了涉案徐9201A植物新品種權之獨占實施權，任何人未經權利人許可，不得為商業目的將該授權品種的繁殖材料重復使用于生產另一品種的繁殖材料。《測試報告》結果顯示：對徐9201A和署名“津1007A”品種進行DNA差異分析，在所測試的所有標記中，未發現兩樣品間存在差異。也就是說被告海豐農場在實際制種過程中不是將“津1007A”的繁殖材料，而是將涉案授權品種徐9201A的繁殖材料用于生產另一品種的繁殖材料。被告海豐農場的行為未經原告許可，且系為了商業目的，侵犯了原告徐9201A植物新品種權之獨占實施權。

被告海豐農場還認為，即使構成侵權，但其生產的涉案種子沒有進行銷售，沒有實際侵占原告的市場利益，因此也不應承擔賠償責任。一審法院認為，是否已經銷售還要看被告所承認的庫存數量與實際的制種數量是否一致或者有無其他處分行為，這些需要被告提供相關證據予以證明。對于生產涉案種子的數量，被告前后作了不同的陳述，實際的制種數量尚無證據予以證明。相關理論文獻表明，雜交粳稻制種畝產在150-240公斤左右。被告與金泰公司訂立的津粳優68品種育種回收合同表明，其畝產在143公斤左右[制種畝數700畝，產量（供貨量）10萬公斤]。原告委托他人制種9優418，每畝產量在140-160公斤左右。這些制種理論和實踐表明，在正常的制種條件下，雜交粳稻制種的畝產量一般在140-160公斤左右。被告沒有陳述或者舉證證明在制種期間發生過自然災害等造成減產的情況。據此，可以推定被告制種實際每畝產量在140-160公斤左右，又因其制種700畝，故可以推定被告實際的制種數量大概在10萬公斤左右。該數量與被告陳述的庫存數量存在較大的差距，其余種子被如何處理，被告沒有舉證予以證明。因此，被告所謂所育種子沒有進行銷售，未損害原告的市場利益的辯解缺乏事實依據，一審法院不予采信。

關于賠償責任的范圍，一審法院認為，徐9201A是不育系，一般由品種權人或者其利害關系人控制，不在市場上公開銷售。其價值不能通過市場銷售價格、數量、利潤等來衡量，更多地是作為繁殖材料用于培育另一品種，并通過該品種之特性和價值體現出來。被告將涉案徐9201A繁殖材料用于生產另一品種（組合）。在該組合及其品種來源中，徐9201A是唯一獲得植物新品種權的品種，在組合中起到了關鍵的作用。因此，被告所獲利潤的大部分應當計算在賠償范圍內。關于賠償數額的計算方式，可以根據被告實際的制種數量減去其現有庫存乘以每公斤種子的銷售利潤，加上原告為制止被告的侵權行為所支出的合理費用，再從中減去酌情確定的父本所起作用并產生的利潤等來計算。關于實際的制種數量，即為上述推定的10萬公斤左右。關于庫存的數量，被告在本案庭審程序中第一次陳述和在鹽城市農業局行政查處程序中陳述均為2.5萬公斤（50000斤），并經由一審法院查驗；后又陳述有5萬公斤，但是沒有提供相關證據證明，故而一審法院以被告第一次承認的數量為準進行計算。關于銷售利潤，原告主張按照市場平均利潤來計算，并提供了相關育種回收合同、銷售合同、購買相關種子的銷售發票等予以證明。被告則認為，被告方沒有實際銷售故而沒有獲得利潤，原告所謂的利潤計算方式沒有事實和法律依據，也不合理。一審法院認為，本案中缺乏直接的證據證明被告所獲利潤，原告亦較難獲取相關證據?？紤]到雜交粳稻種子的市場銷售情況和相關主管部門掌握的情況，原告的該主張具有合理性。一審法院將綜合考慮津粳優68品種之金泰公司的回收價格、市場銷售價格；9優418品種的回收價格、市場銷售價格；合理的加工成本等因素，酌情確定一個合理的利潤數值。

被告不服一審判決，向江蘇高院提起上訴。

江蘇高院二審認為：

一、《測試報告》可以作為認定本案侵權成立的證據使用

江蘇高院二審特別要求雙方當事人提供技術專家作為訴訟輔助人出庭，就涉案DNA鑒定方法問題向法庭進一步作出說明。李強專家在庭審中回答了雙方當事人以及法庭的詢問。歸納起來有以下幾點：1、植物基因DNA提取方法主要有SDS法、CTAB法和試劑盒法。SDS法和CTAB法的原理一致，只是使用的試劑不同，但都是通過破壞細胞壁把DNA析出來，再通過離心提出DNA。而試劑盒法則是通過濾膜析出DNA，再通過洗脫提出DNA。但無論使用哪一種方法提取出的DNA結構都是一樣的，對實驗結果沒有影響。2、水稻DNA的傳統提取方法是SDS法。試劑盒法比較快速，但至少是SDS法的成倍花費。國家標準推薦SDS法，是因為做試驗時一般都推薦“物美價廉”的方法。3、GB/T20396-2006中沒有要求提供圖譜。二審法院認為，一審采信《測試報告》作為認定侵權行為成立的依據充分，二審李強專家出庭所作的技術說明，可以印證一審《測試報告》以及鑒定機構回函的內容，具有科學依據，應予采信。首先，一審法院提出的委托鑒定要求是：“署名為津1007A和徐9201A的兩份水稻樣品在國家標準GB/T20396-2006中規定的48對SSR標記間是否存在DNA水平差異”。在鑒定過程中，鑒于檢材“津1007A”劍葉已經霉變這一客觀事實，鑒定機構在采用國家標準SDS法以及CTAB法提取DNA均無法滿足實驗要求的情況下，采用試劑盒法提取“津1007A”DNA，符合專業領域提取DNA的常規，且技術專家出庭時也說明上述三種方法提取DNA均不會改變DNA的結構和性質，因而最終不會影響“津1007A”和徐9201A兩份水稻樣品DNA比對結果的科學性和準確性。其次，鑒定機構選擇國家標準GB/T20396-2006作為鑒定依據，無需事先征得雙方當事人的同意，除非當事人在確定委托鑒定事項時已經對鑒定標準的選擇提出了明確限定?，F上訴人對此提出質疑，需要有足夠的反對理由和依據。第三，鑒定機構根據委托鑒定要求及國家標準GB/T20396-2006進行鑒定時，根據檢材已經霉變的實際情況變通適用試劑盒法，亦無需征得雙方當事人的同意。因為，植物DNA鑒定目前已經是一項常規鑒定，并不具有特別的技術難度，而本案鑒定機構系農業部轉基因生物產品成分監督檢驗機構，持有國家農業部頒發的《審查認可證書》和中國國家認證認可監督管理委員會頒發的《資質認定計量認證證書》，在DNA鑒定方面具有足夠的專業性，其完全具有獨立決定適用何種測試方法的專業能力。第四，本案鑒定報告是否需要附加帶型圖譜，取決于國家標準以及委托鑒定時的具體要求。經查，目前有關DNA鑒定報告格式和內容表述的相關國家標準中，均無附加帶型圖譜的要求。因為鑒定報告中的文字說明、測試數據以及帶型圖譜均是對鑒定結果的客觀記錄和體現。因國家標準并沒有要求提供圖譜，這表明文字說明和測試數據已經能夠清晰地體現測試結果，并足以據此給出鑒定結論。同時，一審法院在委托鑒定之前，雙方當事人亦未對測試報告的格式和內容，以及是否需要附加帶型圖譜提出特別要求。因此，在鑒定程序已經結束，鑒定機構已經完成鑒定事項且正式出具鑒定報告的情況下，再要求鑒定機構出具帶型圖譜不盡合理。至于上訴人對鑒定機構的公正性表示質疑，二審法院認為，任何質疑均需要提供足夠的證據加以支持。當然，為盡量減少當事人對植物DNA鑒定報告的質疑，今后法院可以考慮在審理類似案件確定委托鑒定事項時，經征求雙方當事人意見，明確向鑒定機構提出鑒定報告附加帶型圖譜的要求。基于以上理由，二審法院認為，上訴人主張鑒定程序違法、鑒定結論依據不足、一審認定侵權成立證據不足的上訴理由均不能成立，不予采納。

二、一審判決確定的賠償額并無不當

本案一審確定賠償數額的計算公式是，以被告的實際制種數量減去其現有庫存乘以每公斤種子的銷售利潤，加上原告為制止被告侵權所支出的合理費用，再從中減去酌情確定的父本所起作用并產生的利潤等來計算原告的損失。二審法院認為，一審確定的計算公式具有合理性，綜合考慮的各項因素適當，對此一審判決也已作出了詳盡說理。其一，就制種數量而言，上訴人二審自認其收購的種子數量為91556公斤，說明一審根據制種理論和實踐并結合相關調查，推定上訴人實際制種數量在10萬公斤左右是符合實際的。其二，以上訴人的實際制種數量減去其庫存數量，體現了公平；其三，一審以獲得植物新品種權保護的徐9201A的價值，作為確定被告所獲利潤的主要比例也是恰當的。因為，被告將涉案徐9201A繁殖材料用于生產另一品種（組合），而在該組合及其品種來源中，徐9201A是唯一獲得植物新品種權的品種，在組合中起到了關鍵的作用；同時，一審已經酌情確定父本金恢68在組合中所起的作用，并在賠償額中予以酌減，也體現了公平。其四，在確定銷售利潤時，一審法院認為，因本案中缺乏直接證據證明被告所獲利潤，原告亦較難獲取相關證據，故根據雜交粳稻種子的市場銷售情況以及相關主管部門掌握的情況，綜合考慮津粳優68品種之金泰公司的回收價格、市場銷售價格；9優418品種的回收價格、市場銷售價格；合理的加工成本等因素，酌情確定合理的利潤數值。盡管二審中上訴人主張其與金泰公司的合同價款為140萬元，要求扣除其制種成本，認為一審判決的賠償額過高。但二審法院認為，上訴人是被控侵權物的生產商，其所制侵權種子進入市場后必然侵占被上訴人的市場份額，給被上訴人造成較大損失。同時，要特別指出的是，雜交水稻在我國糧食生產、糧食安全中起著重要作用。新品種選育工作中最重要、最困難的是不育系的選育，需要克服育種材料種質資源來源少、不育基因導入難、性狀不易穩定、雜交親和力差等諸多困難，傾注了科技工作者的極大心血。而本案侵犯的徐9201A是品種權人經過長達十多年的刻苦攻關選育成功的雜交粳稻三系不育系。因此，一審綜合各種因素確定140萬元賠償額并無不當，充分體現了對植物新品種權加大知識產權司法保護力度的精神。

一審判決：一、被告海豐農場于判決生效之日起立即停止對原告涉案徐9201A植物新品種權之獨占實施權的侵害；二、被告海豐農場于判決生效之日起10日內賠償原告經濟損失140萬元。

二審判決：駁回上訴，維持原判決。

一審合議庭：姚兵兵 葉波平 徐 新

二審合議庭：宋 健 陳芳華 張長琦

dna提取的流程ctab3

張玉雙, 于富洋, 吳忠冰, 王一然, 李晶. 食管鱗癌原位模型小鼠腸道菌群分析. 中國全科醫學[J], 2022, 25(08): 945-951 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.01.501

ZHANGYushuang, YUFuyang, WUZhongbing, WANGYiran, LIJing. Analysis of Gut Flora in a Mouse Model of Esophageal Squamous Cell Carcinoma in Situ. Chinese General Practice[J], 2022, 25(08): 945-951 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.01.501

最新的《全球癌癥統計報告》數據顯示，2020年全球食管癌新發病例數為60.4萬例，死亡病例數為54.4萬例，分別占全球癌癥新發、死亡總病例數的3.1%、5.5%[1]。食管癌發病風險地域差異較大，我國是食管癌發病高風險國家，據統計2020年我國新發食管癌病例數為32.4萬例，死亡病例數為30.1萬例，分別占全球食管癌新發、死亡總病例數的53.7%、55.3%[2]。我國食管癌患者病理類型以鱗癌為主，早期行根治術后預后較好，但由于相當多的食管癌患者確診時已處于中晚期，失去了手術機會，因此提高食管癌早期診斷率仍具有十分重要的意義。

隨著高通量測序技術的應用與發展，腸道微生態研究已成為目前腫瘤領域研究的熱點之一。有研究證實腸道菌群在腫瘤的發生、發展中具有重要作用，食管鱗癌患者口腔、癌組織及癌旁正常組織中菌群結構發生了改變并與食管癌的發生有關[3,4]。因腸道菌群的影響因素較多，本研究特選取飼養環境可控的食管鱗癌原位模型小鼠，以觀察與食管鱗癌相關的腸道菌群結構變化、篩選出特異性改變的腸道菌屬，為食管鱗癌的早期篩查提供參考。

1　材料與方法

1.1　實驗動物

從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買雌性SPF級C57BL/6小鼠20只〔合格證號：SCXK（京）2016-0006〕，體質量14~17 g，鼠齡6周。適應性喂養1周后將所有小鼠隨機分為對照組（DZ組）和模型組（MX組），每組10只。所有實驗操作嚴格遵照河北醫科大學實驗動物中心指南執行，遵守動物保護、動物倫理原則及相關規定。本實驗時間為2020年8月至2021年5月。

1.2　干預方法

DZ組小鼠常規喂養32周，全程給予普通飲用水；MX組小鼠按照造模方法常規喂養并給予含0.1 mg/ml的誘癌劑4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）飲用水喂養16周，之后給予普通飲用水喂養至32周。4NQO飲用水制備方法：將誘癌劑4NQO（購自Sigma-Aldrich公司，型號：N8141）溶解于1，2丙二醇，配制成濃度為2%的母液并保存于-20 ℃冰箱，使用時按照0.1 mg/ml濃度比例混入飲用水中。

1.3　糞便的無菌收集與處理

喂養32周后收集兩組小鼠糞便：在籠具里面放入干凈的濾紙后將小鼠依次放入，每籠1只；用鑷子輕輕刺激小鼠下腹和肛門，待小鼠排便后立即用凍存管進行收集；將凍存管做好標記后放入液氮中，5 min后再將凍存管放入-80 ℃冰箱中保存。最終共收集到20個糞便標本，每組10個。上述操作均在滅菌超凈臺上進行，且所用材料均采用紫外線滅菌處理。

1.4　糞便樣本檢測與數據分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB法）提取糞便標本基因組DNA，應用16SV34區域引物序列341F：CCTAYGGGRBGCASCAG、806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增；將PCR產物進行磁珠純化，并根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳，然后采用膠回收試劑盒回收目的條帶以純化產物；最后使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample PreParation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，經Qubit、Q-PCR定量檢測構建文庫合格后使用NovaSeq6000進行上機測序。

通過對測序序列（Reads）進行拼接、質控和過濾，以97%的一致性將序列聚類成為基于序列間相似度的分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），然后參照Silva138數據庫對得到的OTU序列進行物種注釋，并根據物種注釋情況進一步分析Alpha多樣性、Beta多樣性、物種豐度。

Alpha多樣性分析包括：（1）稀釋曲線：是描述樣本多樣性的曲線，能夠直接反映樣本相關測序數據量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度。（2）Shannon指數：為菌群物種Alpha多樣性分析常用的指數，反映不同樣本間物種多樣性和均一性的差別，Shannon指數越大說明菌群多樣性越高。

Beta多樣性分析：是對兩組樣品間的菌群構成情況進行比較分析。主坐標分析（PCoA）是常用的Beta多樣性分析方法，其基于Unweighted Unifrac距離來進行分析，樣本間距離越遠代表樣本間多樣性差異越大。

物種豐度分析采用T-test檢驗和LEfSe分析，其中LEfSe分析是一種軟件分析，其能夠找到組間有統計學差異的生物標志物。

1.5　食管組織蘇木素-伊紅（HE）染色

完成糞便收集后處死兩組小鼠，剝取其食管組織并采用4%多聚甲醛溶液固定，之后進行石蠟包埋、切片、HE染色，觀察兩組小鼠食管組織病理改變。

1.6　統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，先進行方差齊性分析，之后進行T-test檢驗。Anosim相似性分析用于檢驗組間差異是否大于組內，判斷實驗分組是否存在意義?；趦蓛蓸颖鹃g的距離值排序獲得的秩（組間的為Between，組內的為Within），這樣任一兩兩樣本的比較可以獲得3個分類的數據，并進行箱線圖的展示（若兩個箱的凹槽互不重疊，則表明兩樣本的中位數有顯著差異）。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　食管組織病理改變

兩組小鼠在實驗過程中未出現死亡，MX組小鼠均造模成功。DZ組小鼠食管組織正常，MX組小鼠食管組織可見鱗狀上皮增殖、癌巢形成且癌巢內可見角化珠（圖1）。

Figure 1

Figure 1 HE staining results of esophagus tissues two groups of mice

2.2　腸道菌群測序數據質量評估與OTU分析

對兩組小鼠共20例糞便標本進行16Sr DNA基因測序，對檢測的原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據，平均每樣品測得86 110條tags，經過質控平均得到83 261條有效數據，質控有效數據量達54 489，質控有效率達63.16%。然后基于有效數據進行分析共得到2 314個OTU，再用OTU序列進行物種注釋。結果共有862個OTU注釋到物種屬水平。

基于OTU的Venn圖中，2種不同顏色的圓對應兩組小鼠糞便所含的菌群，重疊部分則為兩組共同含有的菌群，DZ組較MX組腸道菌群物種豐富程度明顯增加，兩組小鼠的腸道菌群結構存在差異，見圖2。同時選擇DZ組與MX組在門水平上豐度排名前10的物種，繪制物種相對豐度柱狀圖（圖3），由圖可見，在門水平上兩組小鼠樣本部分物種豐度存在明顯差異，MX組與DZ組相比，擬桿菌門（Bacteroidota）及厚壁菌門（Firmicutes）比例升高，而疣微菌門（Verrucomicrobiota）及變形菌門（Proteobacteria）比例降低。

Figure 2

Figure 2 Venn diagram of intestinal flora between two groups of mice

Figure 3

Figure 3 Relative abundance of species at phylum level intestinal flora of mice between two groups

2.3　兩組小鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

2.3.1　兩組小鼠腸道菌群物種多樣性曲線

兩組小鼠菌群稀釋曲線均趨于平坦，則說明目前樣本測序數據量漸進合理，即使增加數據量也只會產生少量新的物種，見圖4。

Figure 4

Figure 4 Rarefaction curve of intestinal flora between two groups of mice

2.3.2　兩組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數組間差異分析

MX組腸道菌群Shannon指數低于DZ組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

Table 1 Shannon Diversity Index analysis of intestinal flora between two groups of mice

2.4　兩組小鼠腸道菌群Beta多樣性指數組間差異分析

PCoA圖顯示，MX組與DZ組樣本基本上分別聚集在不同的象限，相距較遠，樣本間多樣性差異較大（t=22.444，P=0.004），見圖5。

Figure 5

Figure 5 PCoA diagram of Beta persity in intestinal flora between two groups of mice

2.5　兩組小鼠腸道菌群組間差異物種分析

2.5.1　兩組小鼠腸道菌群組間與組內差異性分析

Anosim相似性分析結果顯示，兩組小鼠腸道菌群差異組間大于組內，差異有統計學意義（R=0.476，P=0.001），見圖6。

Figure 6

Figure 6 Analysis of similarities （ANOSIM） of intestinal flora between two groups of mice

2.5.2　腸道菌群差異物種分析

在門水平，MX組未明確細菌（Unidentified_ Bacteria）、藍細菌（Cyanobacteria）、易感微生物（Elusimicrobia）、彎曲桿菌（Campilobacterota）豐度高于DZ組，差異有統計學意義（P均<0.05），見圖7。

Figure 7

Figure 7 Differential species analysis of intestinal flora at the phylum level between two groups of mice

在屬水平，共有27類菌的豐度在兩組小鼠腸道菌群內有差異（P均<0.05）。豐度較高的前10位腸道菌群：MX組普雷沃菌科_UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、擬桿菌屬（Bacteroides）、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、普雷沃菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、普雷沃菌屬（Prevotella）、大腸埃希菌（Colidextribacter）、毛螺菌科_UCG-006（Lachnospiraceae_UCG-006）豐度高于DZ組，羅姆布茨菌（Romboutsia）、土桿菌屬（Turicibacter）豐度低于DZ組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖8。

Figure 8

Figure 8 Differential species analysis of intestinal flora at the genus level between two groups of mice

2.5.3　兩組小鼠腸道菌群LEfSe分析

LEfSe分析結果顯示，兩組共有21種腸道菌群豐度有差異，其中梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、毛螺菌目（Lachnospirales）、Prevotellaceae_UCG-003、腸桿菌目（Enterobacterales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、大腸埃希菌種（Escherichia_coli）、顫螺旋菌目（Oscillospirales）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group、顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）豐度在MX組升高，另外Peptostreptococcales_Tissierellales、Romboutsia_ilealis、Romboutsia、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）豐度在DZ組升高（P<0.05）。在屬水平上，Prevotellaceae_UCG-003、Escherichia-Shigella、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group在MX組豐度增高；Romboutsia豐度在DZ組增高（P<0.05），見圖9。

Figure 9

Figure 9 Histogram of LEfSe analysis of intestinal flora between two groups of mice

3　討論

腸道是一個復雜的微生態系統，其擁有一個密集而多樣的微生物群落，稱之為腸道菌群，該菌群與宿主共同進化以建立相互關系[5]。腸道菌群對宿主健康的主要作用表現在分解不可消化的碳水化合物[6]、合成維生素[7]、調節宿主防御[8]及調控腫瘤[9]，尤其在腫瘤生長過程中發揮了重要作用。已有研究表明腸道菌群與多種腫瘤的發生、發展和治療效果密切相關，如結直腸癌[10,11]、肺癌[12]、胃癌[13]、肝癌[14]、黑色素瘤[15,16]等。目前有關腸道菌群在結直腸癌方面的研究較多，已發現部分特異性差異菌群，并進行了深入的機制研究，如研究發現Colidextribacter通過增加癌基因bcl-2和bcl-xl的表達，抑制結腸細胞凋亡，從而促進腫瘤的形成[17]。產腸毒素脆弱擬桿菌可產生脆弱擬桿菌毒素，與結腸上皮細胞相互作用，激活調節性T淋巴細胞并降低白介素（IL）-2水平，隨著IL-2水平的下降，輔助性T淋巴細胞（Th37）的產生導致IL-17水平升高，促進癌細胞存活和增殖[18]。雙歧桿菌能增強樹突狀細胞功能，導致腫瘤微環境中CD8+ T細胞的啟動和聚集介導效應，從而增加程序性死亡受體-配體1（PD-L1）特異性抗體治療效果，抑制結腸癌的發展[19]。

關于腸道菌群和食管鱗癌相關性的研究較少，目前文獻已報道的差異菌群多為從口腔取材，腸道菌群報道較少。位俊敏等[20]研究發現食管癌患者口腔中卟啉菌屬表達升高。ZHAO等[4]報道食管癌患者唾液菌群中顯著增加的菌群為Firmicutes、革蘭陰性菌門（Negativicutes）、硒單胞菌門（Selenomonadales）、Prevotellaceae、Prevotella和韋榮菌科（Veillonellaceae），而Proteobacteria、β-變形桿菌門（Betaproteobacteria）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）和奈瑟菌屬（Neisseria）則顯著減少。而DENG等[21]研究發現在屬水平上，食管鱗癌患者糞便中鏈球菌（Streptococcus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、Subdoligranulum、布勞特菌屬（Blautia）、Romboutsia、柯林斯菌屬（Collinsella）、Paeniclostridium、多爾菌屬（Dorea）和阿托波菌屬（Atopobium）豐度顯著增加，而毛螺菌屬（Lachnospira）、Bacteroides、Agathobacter、Lachnoclostridium、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、帕拉普菌屬（Paraprevotella）等菌屬豐度降低?？梢娚鲜鲅芯繄蟮赖木捍嬖诤艽蟛顒e，縱觀之前文獻報道的雖為同一類型腫瘤患者，但腸道菌群中檢測出的具有統計學意義的菌群差別也較大，考慮腸道菌群是一個復雜的微環境，容易受到患者飲食、情志、基礎疾病及藥物等的影響，故本研究選取4NQO原位誘導食管癌模型小鼠糞便為檢測標本，最大限度使飲食、環境等外界因素達到統一性，盡量避免誤差。

本研究結果顯示，MX組與DZ組相比腸道菌群的物種豐富度和多樣性明顯降低。兩組腸道菌群差異物種分析顯示，MX組小鼠糞便中Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcus、Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella、Colidextribacter、Lachnospiraceae_UCG-006豐度高于DZ組，Romboutsia、Turicibacter豐度低于DZ組。LEfSe分析結果顯示，在屬水平上，Prevotellaceae_UCG-003、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group在MX組豐度明顯增高，Romboutsia豐度在DZ組明顯降低。兩種檢驗分析中均有統計學差異的菌屬為Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Romboutsia，這4種菌屬可能更具有生物標志物意義。Bacteroidota是腸道菌群的主要成分，其與Firmicutes約占腸道菌群的90%以上，研究證實擬桿菌屬（Bacteroidetes）在結直腸癌患者糞便菌群中豐度明顯增高[22,23]，并有研究發現擬桿菌屬在食管鱗癌診斷中準確率較高[21]；Prevotellaceae在食管癌患者口腔菌群中及結直腸癌患者糞便菌群中豐度雖有明顯增高[4,24]，但本研究結果與其一致。但Lachnospiraceae_NK4A136_group及Romboutsia在結直腸癌及胃癌等腫瘤患者中豐度雖有明顯變化[21,25,26]，但本研究結果與之不同，因此還需進一步研究檢測確定。

綜上所述，食管鱗癌原位模型小鼠腸道菌群物種多樣性降低，存在特異性差異菌屬，可為食管癌的診斷提供參考。雖然本研究發現了MX組較DZ組小鼠腸道菌群顯著改變，但16SrDNA為半定量檢測，故仍需宏基因組學或靶向微生物學的研究進一步明確差異菌群，并進行更加深入的機制研究來進行驗證，尋找食管鱗癌特異性的靶菌群。

本文無利益沖突。

本文表格略

參考文獻略